背景高

膜沒有W全均勻濕透

使用100% 甲醇浸透膜5-10min

洗膜不充分

增加洗液體積和洗滌次數

阻斷不充分

增加封閉液孵育時間，或者提高溫度。選擇合適的封閉試劑（脫脂奶粉，BSA，酪蛋白等）

二抗濃度過高

降低二抗濃度

檢測過程中膜干燥

保證充分的反應液，避免出現干膜現象

曝光過度

縮短曝光時間

抗體與阻斷蛋白有交叉反應

檢測抗體與阻斷蛋白的交叉反應性，選擇無交叉反應的封閉劑。洗滌液中加入Tween-20可減少交叉反應

沒有陽性條帶，或者陽性條帶比較弱

抗體染色不充分

增加抗體濃度，延長孵育時間

酶失活

直接將酶和底物進行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內、有活性的酶聯物

標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低

設置陽性對照，如果陽性對照有結果，但標本沒有則可能是標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考慮增加標本上樣量解決靶蛋白含量低的原因。

試劑不匹配

一抗與組織種屬，一抗與二抗或/和底物與酶系統之間不匹配。通過設置內參照可以驗證二級檢測系統的有效性

一抗失效

選擇在有效期內抗體；并選擇現配現用的工作液

HRP抑制劑

所用溶液和容器中避免含有D氮化鈉

膜沒有W全均勻濕透

使用100%甲醇浸透膜

靶蛋白分子量小于10Kd

選擇小孔徑的膜，縮短轉移時間

甲醇濃度過高

過高甲醇濃度會導致蛋白質與SDS分離，從而沉淀在凝膠中，同時會使凝膠收縮或變硬，從而抑制高分子量蛋白的轉移。降低甲醇濃度或者使用乙醇或異丙醇代替

轉移時間不夠

對于厚的膠以及高分子量蛋白需要延長轉移時間

抗體染色不充分

增加抗體濃度，延長孵育時間

標本中靶蛋白含量太低

增加標本上樣量。

HRP抑制劑

所用溶液和容器中避免含有D氮化鈉

抗體活性降低

選擇在有效期內的抗體，工作液現配現用，避免長時間放置

封閉過度

減少封閉劑的量或縮短時間；換用不同封閉劑類型

曝光時間過短

延長曝光時間

條帶位置不對；或有非特異性條帶

色帶）

二抗的非特異性結合

增加一個對照：不加一抗，其他操作過程不變，即可驗證背景是否由二抗系統來源。選擇其他二抗（特異性更強的，只針對重鏈的）

一抗的特異性不夠

使用單克隆或者親和純化的抗體，保證抗體的特異性

蛋白降解

使用新鮮制備的標本，并使用蛋白酶抑制劑

二聚體或多聚體存在

增加蛋白質變性過程及強度

抗體濃度過高

降低抗體（一抗、二抗）濃度，可以減少非特異性條帶

蛋白上樣量過大

降低上樣量

封閉劑中有聚集體

使用前過濾封閉試劑

HRP耦聯二抗中有聚集體

過濾二抗試劑，去除聚集體

HRP含量過高

降低酶聯二抗的濃度